商品屬性：

該制品為雙組分的試劑，Basic Buffer Mix 包含了反應緩沖液、Mg2+、dU/A/C/GTP(不含 dTTP)、凍干賦形劑，酶 Mix 包含 Bst 4.0 DNA/RNA 聚合酶、熱敏 UDG。得益于 Bst 4.0 識別 dUTP 底物，反應底物中不包含dTTP，因此擴增產物均為 dUTP 產物，在配合熱敏 UDG的情況下，實現(xiàn)防污染性能。在實際測試中，含有 10e5Copies 的污染物的條件下，抑制污染擴增。本制品尤其適用于開蓋的 LAMP 反應（如試紙條檢測）、密封腔體（污染風險較高）的檢測試驗（如定量 PCR腔體）。
試劑使用特點：
（1）Basic Buffer Mix 中不含染料，可自行添加 SYBR Green、Eva Green 等染料進行熒光檢測。
（2）本試劑適用于開蓋檢測如核酸試紙條檢測。
（3）試劑中含有凍干賦形劑，試劑可直接凍干，無需再優(yōu)化凍干配方。

儲存：-20℃保存 1 年；-80℃保存 2 年；短期使用放置于2-8℃，保存 1 個月。反復凍融 10 次，不影響使用。如有白色沉淀，于 37℃水浴放置 10min 后溶解沉淀，不影響使用。
使用方法：
1. 配制 LAMP 反應體系
2.5xBst4.0 Basic BufferMix 10 μl
25xBst4.0/UDG Enzyme 1 μl
10xLAMP Primer Mix 2.5 μl
模板 DNA/RNA X μl
ddH2O 到總體積 25 μl
10xLAMP Primer Mix 濃度：FIP/BIP 分別為 16 μM、LoopF/B 分別為 4~8 μM、F3/B3 分別為 2 μM。
注意：如何應用核酸試紙條進行特異性檢測，可來信咨詢。
2. 反應體系配好后，室溫（25-37°C）放置 2min，以消化去除潛在的核酸污染，隨后置于 65°C 進行反應15~30min。
試劑凍干策略（有凍干經驗人員操作）：
1. 配制 LAMP 凍干體系
2.5xBst4.0 Basic BufferMix 10 μl
25xBst4.0/UDG Enzyme 1 μl
10xLAMP Primer Mix 2.5 μl
ddH2O 到體積 1.5 μl
凍干總體積 15 μl
2. 體系配制完畢后，加入 0.2 ml EP 管進行上機凍干。該試劑的凍干體積為 15 μl， 檢測反應體積為 25 μl。

特別說明：
（1）本試劑防污染原理為：熱敏 UDG 消化去除含有 dUTP的擴增產物，熱敏 UDG 在隨后 50℃以上迅速失活，并不影響后續(xù) LAMP 擴增。因此，本試劑無法去除采用 dTTP擴增的污染物，也不能消化天然的核酸底物（DNA/RNA）。為避免擴增氣溶膠污染，實驗室應長期使用本試劑進行實驗，一旦使用 dTTP 試劑擴增后，造成實驗室污染，采用本試劑不會消除假陽性擴增。
（2）本試劑適用基于 OG 染料變色法、SYBR Green 法、基于 Biotin/FAM 探針的核酸膠體金法（ 具有膠體金法特異性使用策略，如需技術支持，請來信咨詢）。本試劑不支持 HNB、pH 顯色法。其它使用策略自行優(yōu)化調整。
（3）基于本試劑， 提供凍干制備服務。八聯(lián)管起訂量 480T，凍干球起訂量 2000T。

PCR基本步驟及注意事項？

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法，它類似于生物體內DNA的復制。在生物體內DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應同樣需要類似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列，實現(xiàn)對特定位置的擴增；PCR Buffer提供一個反應的緩沖環(huán)境；反應過程同生物體內一樣，DNA雙鏈打開，引物結合模板，延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應溫度實現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈，在退火溫度處引物結合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復重復此過程即可實現(xiàn)對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環(huán)開始才產生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子，進一步循環(huán)地產生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數(shù)擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續(xù)大量擴增，達到較高水平。因此，應適當調節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺期前結束反應， 減少非特異性產物。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產物，cDNA等，但不能為RNA。對于不同類型的模板，其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠，質粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產物預變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結合，合成另一條鏈。從第二輪開始，兩個引物均與特異位點結合，從而實現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增，原因就在于實現(xiàn)PCR反應的是DNA聚合酶，只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來說，一般25ul體系DNA的質量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響，故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質粒及PCR產物由于其結構簡單，且提取濃度一般較低，則無需稀釋。

PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準);

2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解?？赏ㄟ^PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準確。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實驗設計和目的進行。

1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優(yōu)化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。

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